Je těžší odhalit než EPO, genový doping je méně uváděnou frontou v boji za čistou cyklistiku
Historie dopingu a antidopingu je něco jako Wile E. Coyote honí Road Runner: bez ohledu na to, jak blízko se Wile E. dostane k Road Runnerovi, ten je vždy o krok napřed. Zdá se, že to platí ještě více pro nový, temný kout dopingu, který může znít jako sci-fi scénář, ale ve skutečnosti existuje již nejméně dvě desetiletí: genový (nebo genetický) doping.
Ale navzdory rychlému rozvoji genového dopingu může nová metodika testování genového dopingu představovat důležitý obrat proti používání genů pro účely zvyšování výkonnosti.
ADOPE (Advanced Detection of Performance Enhancement) byl představen na University of Stirling ve Skotsku na začátku září a je jedním z mála známých testů proti genovému dopingu.
Metoda byla vyvinuta skupinou vědců z Technické univerzity v Delftu v Nizozemsku a bude soutěžit s více než 300 dalšími týmy v soutěži Geneticky upravený stroj v roce 2018; slavnostní předávání cen se bude konat v Bostonu, MA, 28. října.
Za prvé: co je genový doping?
Genový doping je „zneužití“genové terapie pro účely zvýšení výkonnosti. Genová terapie je na druhé straně technika, která k léčbě nebo prevenci nemocí používá spíše geny než léky nebo operace.
Terapie spočívá v dodání vnějšího genetického materiálu do buněk pacienta. Genetický materiál – který obsahuje specifický výraz, který aktivuje proteiny používané k léčbě onemocnění – je vložen do buněk pomocí externího vektoru (obvykle viru).
Vezměme si například EPO. Erytropoetin – protein, který stimuluje tvorbu červených krvinek v kostní dřeni a následně zvyšuje hladinu hemoglobinu v těle a dodávání kyslíku do tkání – je normálně vylučován ledvinami.
Injekce EPO byly notoricky známým vylepšením výkonu, které cyklisté zneužívali již několik let, zejména v 90. letech.
V dnešní době, i když jsou případy pozitivity EPO stále hlášeny, je stále těžší se této praxi zbavit, protože antidopingové kontroly dokážou v dnešní době velmi efektivně detekovat vnější EPO.
Alternativa genového dopingu, která zvyšuje produkci EPO prostřednictvím vložení nového genetického materiálu do sportovce, by však nakonec vypadala jako přirozený produkt vlastní fyziologie sportovce a ne jako zakázaná látka.
I když se genová terapie stále používá pouze u vzácných onemocnění, která nelze vyléčit (jako je těžká kombinovaná imunodeficience, slepota, rakovina a neurodegenerativní onemocnění), vědci přiznali, že se na ně obrátili lidé ze světa sportu a požádali je, aby používali tyto terapie jako způsob, jak zlepšit jejich sportovní výkony.
WADA a genový doping
Světová antidopingová agentura (WADA) zorganizovala první workshop k diskusi o genovém dopingu a jeho hrozbách v roce 2002, zatímco o rok později byla tato praxe uvedena na seznamu nelegálních látek a metod WADA.
Od té doby věnuje WADA část svých zdrojů na umožnění detekce genového dopingu (včetně vytvoření několika skupin a panelů expertů na genový doping) a v roce 2016 byl implementován rutinní test genového dopingu EPO v laboratoři akreditované WADA v Austrálii, Australian Sports Drug Testing Laboratory.
Testovací metodiky pro genový doping však mohou být pracné a vyžadují širokou znalost specifické sekvence DNA pro skutečnou testovací praxi.
Metoda navržená ADOPE se na druhé straně zaměřuje na cílené sekvenování a kombinuje přínosné principy ostatních metod potenciálně efektivnější a cílenější.
Metodika testování ADOPE
Testovací metodologie ADOPE byla vyvinuta prostřednictvím testů provedených na hovězí krvi a je strukturována do dvou fází: první je fáze předběžného screeningu, která se zaměřuje na potenciální geny dopovanou krev, zatímco druhá se zaměřuje na specifické genetické sekvence ověřit, zda byla DNA skutečně genově dopována nebo ne.
'V předběžném screeningu,' vysvětluje Jard Mattens, manažer lidských postupů týmu TU Delft, který vyvinul ADOPE, 'dále rozvíjíme použití takzvaných zlatých nanočástic s dextrinovou čepičkou pro detekci genového dopingu.
'Princip je založen na skutečnosti, že zlaté nanočástice vyvolávají postupnou kvantifikovatelnou barevnou změnu vzorku, pokud obsahuje "dopingovou" DNA.'
Aby mohl tým TU Delft pracovat na „genem dopované DNA“a testovat ji – ale bez nutnosti skutečně genově dopovat sportovce nebo zvířata – uměle „obohatil“hovězí krev několika komplementárními sekvencemi DNA.
Cílem jejich testů bylo zacílit a najít „genem dopované“sekvence, které přidali do krve.
'Používáme hovězí krev jako dobrou náhradu lidské krve, protože princip funguje stejným způsobem,' vysvětluje Mattens.
'Pro náš test jsme do této hovězí krve přidali několik typů DNA v různých koncentracích, abychom napodobili vývoj koncentrace v průběhu času podle toho, co jsme dříve modelovali pro lidi.
'Od této chvíle bude naše detekční metoda stejná a DNA, kterou jsme přidali do hovězí krve, by měla být detekována naší metodou.'
Jakmile byla identifikována potenciálně genově dopovaná krev kvůli změně její barvy, následuje druhá fáze testu zaměřená na specifické sekvence, které byly přidány do krve.
'Pro ověření tohoto úvodního screeningu,' pokračuje Mattens, 'používáme technicky unikátní a inovativní CRISPR-Cas – fúzní protein Transposase.
'To lze považovat za nanostroj, který je schopen specificky detekovat specifické rozdíly přítomné v genové dopingové DNA.'
CRISPR nebo CRISPR-Cas9 (neboli editace genů) je odlišná a pokročilejší technika, která umožňuje genetikům, kteří používají dvě molekuly – enzym zvaný Cas9 a kousek RNA – k vytvoření změny (mutace) do DNA.
Tato technika byla také zakázána WADA od začátku roku 2018 jako pokročilejší genově-dopingová technika, ale v případě ADOPE se k nalezení modifikované DNA namísto její modifikace používá technika CRISPR-CAS.
Specifikum ADOPE
Model testování vyvinutý společností ADOPE byl specificky koncipován a vyvinut k detekci genu, který umožňuje produkci EPO v lidském těle, ale protože je metodika vysoce univerzální, vědci z TU Delft tvrdí, že může být 'rozšířený, aby detekoval jakýkoli druh genového dopingu.'
Na základě cyklu, během kterého je EPO v těle účinný, by nejpravděpodobnější doba, kdy by sportovci dopovali pomocí tohoto specifického genu, byla dlouho před soutěží – ale zároveň by se měly objevit jiné geny, zacílené na různé proteiny a fyziologické vylepšení, může mít mnohem rychlejší účinek.
Proto se ADOPE snaží zavést pravidelné antidopingové testy během celého tréninkového a závodního kalendáře.
Jelikož se však očekává, že takzvaná 'bezbuněčná DNA', na kterou jsou testy zaměřeny, bude v moči velmi nízká (i když je zde také přítomna), ADOPE zatím funguje pouze na krevních vzorcích a jejich detekci okno je stále omezené.
'Na základě experimentálního testu s subhumánními primáty provedeného Ni et al v roce 2011,' říká Mattens, 'očekáváme, že detekční okno bude jen několik týdnů.
'Další vývoj metody by mohl umožnit, aby stejná metoda v budoucnu fungovala i pro moč.'
Rozdíl mezi ADOPE a jinými přístupy
„Většina [ostatních testů genového dopingu] se spoléhá na reakce založené na PCR [Polymerázová řetězová reakce: technika, která vytváří kopie specifické oblasti DNA in vitro], které mají mnoho nevýhod,“dodává Mattens.
'Tyto reakce jsou poměrně pracné a vyžadují rozsáhlé předchozí znalosti sekvence DNA. Navíc použití těchto antidopingových testovacích technologií výrazně zvyšuje pravděpodobnost, že se vyhnete detekci.'
Alternativně se některé další testovací postupy zaměřují na celou sekvenci genomu; tedy celý genetický materiál přítomný v buňce nebo organismu.
Nevýhodou tohoto přístupu je však to, že je třeba vzít v úvahu celou sekvenci genomu, což je časově náročné, neefektivní a mohlo by to být také vnímáno jako narušení soukromí sportovců.
'Náš přístup,' říká Mattens, 'se zaměřuje na cílené sekvenování, které kombinuje přínosné principy z obou přístupů komplementárním způsobem.
'Využívá princip specifičnosti PCR, ale vyžaduje pouze jedno cílové místo na transgenu (ale vyžaduje více míst pro vyhledávání), čímž je pravděpodobnost úniku z detekce výrazně nižší.
'[ADOPE] využívá princip sekvenování sekvenování celého genomu, avšak efektivněji a cíleněji, čímž dramaticky snižuje množství dat.
'V důsledku toho věříme, že cílené sekvenování je mnohem lepší přístup a budoucnost detekce genového dopingu.'
